熒光顯微鏡的原理

熒光顯微鏡是用人眼不可見(jiàn)的一定波長(zhǎng)的紫外線作光源照射被檢物體，使之受激發(fā)后而產(chǎn)生人眼可見(jiàn)的熒光,然后再經(jīng)顯微鏡成像系統(tǒng)放大來(lái)進(jìn)行鏡檢。熒光顯微術(shù)是生物,醫(yī)學(xué)中的重要研究手段，如對(duì)生物組織、生理、病理、微生物、醫(yī)藥、食品、化學(xué)等諸方面的鑒定等。

一、熒光

普通光是由發(fā)光體質(zhì)點(diǎn)的熱運(yùn)動(dòng)所引起的輻射；而熒光是非溫度輻射，是一種冷光。熒光有多種，如光化熒光（由光源激發(fā)而產(chǎn)生的熒光），放射出熒光（由放射性物質(zhì)激發(fā)而產(chǎn)生的熒光）。生物熒光（如磷的氧化時(shí)發(fā)出的熒光），等等。而熒光顯微鏡則是利用光化熒光這原理設(shè)計(jì)制造，達(dá)到熒光顯微術(shù)鏡檢的目的。

由于熒光顯微鏡的光源是利用人眼不可見(jiàn)的短波光，因而就大大提高了物鏡的分辨率，圖像與背景的反差亦甚為明顯。

二、熒光現(xiàn)象

將熒光物體放到光譜中的各色區(qū)域，就可發(fā)現(xiàn)引起熒光最有效的光線是光譜上波長(zhǎng)較短的區(qū)域，即近紫外線區(qū)域，波長(zhǎng)約為320-400nm。這種現(xiàn)象的實(shí)質(zhì)是分子吸收了短光的能量（波長(zhǎng)越短，光能越強(qiáng)），又以發(fā)光的形式以波長(zhǎng)較長(zhǎng)和熒光射出，而為人眼可見(jiàn)，這就是熒光現(xiàn)象。熒光接近可見(jiàn)光的紅光端，大部分的熒光現(xiàn)象是符合這一規(guī)律的。

熒光現(xiàn)象可分為兩種：

1. 第一次熒光現(xiàn)象；又稱固有熒光或自發(fā)熒光，當(dāng)經(jīng)紫外線的照射后，就能發(fā)出熒光的物質(zhì)；

2. 第二次熒光現(xiàn)象：又稱激發(fā)熒光，當(dāng)經(jīng)紫外線照射后不能或只部分發(fā)生微弱的熒光，這樣就需先用熒光素處理，再經(jīng)紫外線照射才能發(fā)生熒光，這是因組織內(nèi)吸附或溶解有熒光素的緣故。

三、熒光顯微鏡的原理

濾色塊是熒光顯微鏡的重要部位，其核心部件由激發(fā)光濾色片（first barrier filter）、發(fā)射光濾色片（second barrier filter）和半透半反濾色片(beam-splitting mirror)組成。

1．激發(fā)光濾色片及發(fā)射光濾色片：根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn)，通常選用以下三類配套，提供一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光，并使樣品激發(fā)出的熒光透過(guò)，到達(dá)目鏡成像。

紫外光激發(fā)：激發(fā)光濾色片可使紫外光透過(guò)，阻擋400nm以上的可見(jiàn)光通過(guò)。與之相應(yīng)的發(fā)射光濾色片可允許藍(lán)光通過(guò)，視野內(nèi)的光呈藍(lán)色，如應(yīng)用于DAPI染色。

藍(lán)光激發(fā)：激發(fā)光濾色片可使藍(lán)光通過(guò)，阻擋其他波段的光。與之相應(yīng)的發(fā)射光濾色片可允許綠光通過(guò)，如GFP 染色標(biāo)記。

綠光激發(fā)：激發(fā)光濾色片使綠光通過(guò)，阻擋其他波段的光。與之相應(yīng)的發(fā)射光濾色片通?？稍试S紅光通過(guò)，如Rhodamine染色。

2．半透半反濾色片：它的作用是完全阻擋激發(fā)光通過(guò)，而將其反射；并透過(guò)相應(yīng)波長(zhǎng)范圍的發(fā)射光。其型號(hào)與激發(fā)光濾色片和發(fā)射光濾色片相對(duì)應(yīng)。

3. 光路：光線在熒光濾色塊中的傳播光路為：反射光濾光片只允許光源中特定波長(zhǎng)的光線透過(guò)，這部分激發(fā)光到達(dá)半透半返濾色片時(shí)被反射后通過(guò)物鏡照射到樣品上，樣品中的熒光基團(tuán)被激發(fā)光激發(fā)，發(fā)射出長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光；發(fā)射光通過(guò)物鏡，透過(guò)半透半反濾色片，到達(dá)發(fā)射光濾色片，此時(shí)又只有特定波長(zhǎng)的光線透過(guò)，最后通過(guò)目鏡被我們?nèi)庋劭吹降木褪菢悠分械臒晒饬恕?/span>